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02021年8月23日/醫麥客新聞 eMedClub News/--最近幾年，腫瘤免疫細胞療法發(fā)展迅速，尤其是CAR-T細胞，已經(jīng)有五款CAR-T細胞療法產(chǎn)品獲得美國FDA批準上市。國內也迎來(lái)了第一款CAR-T細胞產(chǎn)品的上市。
NK細胞的安全性及其抗腫瘤潛力，使它們成為實(shí)施CAR技術(shù)的有希望的細胞類(lèi)型，可將其細胞毒性潛力重定向至特定靶標。目前，CAR-NK細胞的免疫療法研究成為越來(lái)越多研究者的選擇方向。
▲ NK細胞介導的腫瘤細胞毒性機制
NK細胞來(lái)源非常廣泛，比如外周血、臍帶血、胚胎干細胞、人類(lèi)誘導多能干細胞和NK細胞系，不同來(lái)源的NK細胞有著(zhù)各自的優(yōu)勢和缺陷。由于NK細胞可以經(jīng)歷的細胞分裂數量有限，很難擴增為輸注所需的大量細胞。因此，研究者們逐步使用NK細胞系（如NK-92、YTS、KHYG-1等）代替從臍帶或外周血獲得的原代NK細胞進(jìn)行了研究。
CAR-NK細胞的研究進(jìn)展
在血液系統腫瘤中，目前研究較多的為CD19-CAR-NK細胞和CD33-CAR-NK細胞。
▲ CAR-NK細胞在血液瘤中的臨床前研究
1.急性白血病
CAR-T細胞治療急性淋巴細胞白血?。ˋLL）已顯示出顯著(zhù)臨床療效，但該療法對急性髓系白血?。ˋML）療效不佳。從理論上講，CAR-NK細胞比CAR-T細胞具有更有利的毒性，特別是在避免CRS等副作用方面。然而，這方面的臨床數據尚無(wú)報道。
Xiaowen Tang等評估了CD33-CAR-NK細胞在復發(fā)和難治性AML患者中的安全性。該研究共入組3例患者，采用第二代CAR，結果顯示在5x109個(gè)細胞的輸注劑量下，沒(méi)有明顯的不良反應，并且與CAR-T細胞相比，CAR-NK-92細胞的成本生產(chǎn)更低，相信經(jīng)過(guò)優(yōu)化后將被廣泛用于治療腫瘤。
2.淋巴瘤
MD安德森腫瘤中心I/IIa期試驗的結果顯示，以CD19為靶點(diǎn)的臍帶血來(lái)源的CAR-NK細胞療法，在復發(fā)性/難治性非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者和慢性淋巴細胞白血?。–LL）患者中顯現出臨床療效，而且未觀(guān)察到嚴重毒性反應。
該研究共入組11例患者，其中5例CLL患者，6例NHL患者，所有患者均接受最少3線(xiàn)和最多11線(xiàn)的先前治療。8例患者（73%）獲得緩解，其中7例（4例淋巴瘤，3例CLL）完全緩解，1例Richter’s轉化成分緩解，但有持續性CLL。
在注射后30天內，所有劑量水平的反應都很迅速，注入的CAR-NK細胞擴增并維持在低水平至少12個(gè)月。另外，研究結果表明，CAR-NK細胞的使用與CRS、神經(jīng)毒性或GVHD的發(fā)生無(wú)關(guān)，炎癥細胞因子（包括IL-6）的水平也沒(méi)有增加。
Fate Therapeutics公司近期公布異體iPSC衍生的CAR-NK細胞FT596的臨床數據，FT596單藥治療表現出持久的腫瘤清除能力和延長(cháng)的體內存活率，顯示出iPSC衍生的NK細胞療法成為新型癌癥免疫療法的開(kāi)發(fā)前景。
此外，FT596在與利妥昔單抗聯(lián)用時(shí)，與單獨使用利妥昔單抗相比，FT596在體內顯示出對CD20+淋巴瘤細胞殺傷的增強。這初步顯示出，抗體藥物與NK細胞治療聯(lián)合應用可以發(fā)揮協(xié)同效應，將會(huì )是CAR-NK細胞又一個(gè)開(kāi)發(fā)新方向。
3.多發(fā)性骨髓瘤（MM）
MM是在B淋巴細胞分化成漿細胞的過(guò)程中發(fā)生的遺傳突變導致的惡性腫瘤。MM細胞系中常見(jiàn)的腫瘤抗原有CS1、CD138、BCMA等。關(guān)于CAR-NK細胞產(chǎn)品治療MM的研究相對較少。目前用于治療MM的CAR-NK細胞產(chǎn)品多采用NK92細胞系，所采用的腫瘤抗原多為CS1和CD138。
細胞表面糖蛋白CD2子集1（CS1）是MM細胞表面高度表達的蛋白質(zhì)，多參與MM細胞黏附和生長(cháng)。CD138參與MM細胞的黏附、生長(cháng)和成熟，是MM主要的診斷標記。體外研究已經(jīng)證實(shí)，分別利用CS1和CD138為靶點(diǎn)設計的CS1-CAR-NK92細胞和CD138-IFNα-CAR-NK92細胞成功抑制MM細胞生長(cháng)，延長(cháng)了骨髓瘤小鼠的存活期。
CAR-NK用于治療實(shí)體瘤的研究
CAR-T細胞在抗擊實(shí)體腫瘤的過(guò)程中，會(huì )出現PD-1/PD-L1介導的免疫抑制。NK細胞表面PD-1表達很低，相對受腫瘤微環(huán)境免疫抑制小，也許是抗擊實(shí)體瘤的良好候選者。
在實(shí)體瘤研究中，CAR-NK細胞的研究靶點(diǎn)多是靶向表達HER2、PSMA、mesothelin、ROBO1或MUC1等腫瘤相關(guān)抗原的轉移性實(shí)體惡性腫瘤，例如前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌和非小細胞肺癌。
▲ CAR-NK細胞在實(shí)體中的瘤臨床前研究
目前，CAR-NK針對實(shí)體瘤的治療逐漸展開(kāi)。
CAR-NK細胞的挑戰
盡管CAR-NK細胞吸引了很多研究者的目光，其也存在一定問(wèn)題。CAR-NK細胞作為一種治療性癌癥的成功實(shí)施目前受到三個(gè)主要因素的阻礙，即，（1）NK細胞對基因工程的抗性；（2）NK細胞的增殖潛力有限；（3）它們對輸液的持久性有限。
NK細胞對基因工程的抗性挑戰
病毒轉導CAR-NK細胞的挑戰
盡管CAR-NK細胞吸引了很多研究者的目光，其也存在一定問(wèn)題。CAR-NK細胞作為一種治療性癌癥的成功實(shí)施目前受到三個(gè)主要因素的阻礙，即，（1）NK細胞對基因工程的抗性；（2）NK細胞的增殖潛力有限；（3）它們對輸液的持久性有限。
NK細胞對基因工程的抗性挑戰
從歷史上看，逆轉錄病毒或慢病毒對原代NK細胞的病毒轉導效率均較差?；?gamma;逆轉錄病毒的載體需要細胞積極增殖才能進(jìn)入細胞。慢病毒的載體既可以感染循環(huán)細胞也可以感染非循環(huán)細胞，并攜帶較大的轉基因，但由于其生存能力往往受到負面影響，因此它們在原代NK細胞中的效率也受到限制。
電穿孔
基因工程NK細胞的一種非病毒策略是通過(guò)DNA或mRNA質(zhì)粒的電穿孔。DNA的電穿孔效率很低，且無(wú)法在DNA中穩定整合構建體。
轉座子
目前正在研究的非病毒轉導的一種替代方法是使用轉座子。最常用的兩種主要方法——piggyBac和睡美人(SB)轉座子系統，目前正在臨床測試基于SB的CAR載體。
SB最初來(lái)源于魚(yú)類(lèi)，但在人類(lèi)基因組中仍保留其活性。它由兩個(gè)部分組成：介導剪切和粘貼的SB轉座酶和側翼為末端反向重復序列(TIR)的DNA載體，轉座酶可以與之結合以介導其幾乎隨機整合到基因組中。
這種方法可以轉導長(cháng)度大于100kb的基因，使其成為CAR整合的一個(gè)有吸引力的更高效率選擇。轉座子工程化的CAR-NK細胞是一種有前途的替代方法，可以在沒(méi)有病毒整合的情況下實(shí)現穩定表達。
CRISPR/Cas9
先前討論的轉導方法依賴(lài)于載體整合，而沒(méi)有指定整合位點(diǎn)。必需存活基因或腫瘤抑制基因的整合和隨后破壞的可能性對于臨床產(chǎn)品可能是有害和危險的。與轉錄激活因子樣效應核酸酶(TALEN)或鋅指核酸酶(ZFN)等類(lèi)似方法相比，CRISPR/Cas9系統的發(fā)現開(kāi)啟了高效靶向基因整合的可能性。
解決NK細胞的增殖潛力有限的挑戰
1.基于細胞因子的擴增
基于細胞因子的擴增方案通常依賴(lài)于超生理水平來(lái)誘導原代NK細胞的擴增。
2.基于飼養層的擴增
基于飼養層的擴增方案將來(lái)自飼養層系統的受體介導的輸入與細胞因子支持相結合，以促進(jìn)原代NK細胞的大規模擴增。
解決NK體內擴增的挑戰
來(lái)自過(guò)繼細胞療法(ACT)臨床試驗的證據通常無(wú)法在輸注后1-2周內檢測到輸注NK細胞的存在。雖然NK細胞的短壽命有助于它們在A(yíng)CT環(huán)境中的安全性，但它也顯著(zhù)縮小了治療窗口。
小結
目前，全球正在進(jìn)行的臨床試驗進(jìn)行的薈萃分析確定了520項有效試驗，共檢查了64種不同的CAR，其中96.4％的試驗使用CAR-T細胞。因此，就將實(shí)驗室研究轉化為臨床環(huán)境而言，CAR-NK細胞領(lǐng)域仍處于起步階段。
▲ CAR-NK細胞在血液瘤和實(shí)體瘤中的臨床研究
隨著(zhù)CAR-NK細胞療法的臨床價(jià)值凸顯，不管是賽諾菲、百時(shí)美施貴寶等制藥巨頭還是Catamaran Bio、Artiva Bio等生物技術(shù)初創(chuàng )公司都相繼布局CAR-NK賽道。顯而易見(jiàn)，CAR-NK已成為繼CAR-T之后最引人關(guān)注的工程細胞療法。
近些年隨著(zhù)對NK的細胞生物學(xué)，免疫學(xué)，以及記憶性NK細胞的研究和認識越來(lái)越深入以及對于NK細胞的免疫相關(guān)受體的信號通路等新的研究.。越來(lái)越多的研究為NK細胞在免疫治療中的應用奠定了良好的基礎，相信隨著(zhù)理論知識的更加完善，臨床研究的進(jìn)行，以及對當前CAR-NK細胞面臨挑戰的攻克，CAR-NK細胞療法也許會(huì )為腫瘤免疫治療帶來(lái)革命性進(jìn)展，CAR-NK細胞的治療方法在今后也能占據一方舞臺。
參考資料：
1.https://mp.weixin.qq.com/s/a8PZZLfWYf684aH4BfkVUQ
2.https://mp.weixin.qq.com/s/nLKPgREeE3jLJ4O9XxQQEw
近些年隨著(zhù)對NK的細胞生物學(xué)，免疫學(xué)，以及記憶性NK細胞的研究和認識越來(lái)越深入以及對于NK細胞的免疫相關(guān)受體的信號通路等新的研究.。越來(lái)越多的研究為NK細胞在免疫治療中的應用奠定了良好的基礎，相信隨著(zhù)理論知識的更加完善，臨床研究的進(jìn)行，以及對當前CAR-NK細胞面臨挑戰的攻克，CAR-NK細胞療法也許會(huì )為腫瘤免疫治療帶來(lái)革命性進(jìn)展，CAR-NK細胞的治療方法在今后也能占據一方舞臺。
參考資料：
1.https://mp.weixin.qq.com/s/a8PZZLfWYf684aH4BfkVUQ
2.https://mp.weixin.qq.com/s/nLKPgREeE3jLJ4O9XxQQEw
